تولید هورمون رشد انسانی نوترکیب در برخی باکتری های پروبیوتیک

چکیده پروبیوتیک ها میکروارگانیسم های زنده ایی هستند که تأثیرات مفیدی روی سلامتی انسان و حیوان دارند. باکتری لاکتوکوکوس لاکتیس، عضو مشخص شده ی باکتری های اسید لاکتیک می باشد که ویژگی های آن به طور کامل بررسی شده اند. این باکتری ارگانیسم مدل این گروه در نظر گرفته شده است. l. lactis برای تولید پروتئین های زیستی مفید و برای انتقال dna پلاسمیدی به سلولهای یوکاریوتی مناسب می باشد. اخیراً از l. lactisبه عنوان اولین ارگانیسم تغییر یافته ی ژنتیکی زنده برای درمان بیماری های انسانی استفاده شده است. هورمون رشد انسانی یا سوماتوتروپین یک پروتئین تک رشته دارای 191 اسید آمینه به صورت یک ساختار با 4 مارپیچ و دارای دو پل دی سولفیدی و وزن مولکولی حدود 22 کیلو دالتون می باشد. که توسط سلول های سوماتوتروف غده هیپوفیز ساخته شده و به جریان خون آزاد می شود. به علت فعالیت های بیولوژیکی مهم و متنوع هورمون رشد، این هورمون دارای کاربردهای گسترده ایی در پزشکی و بیوتکنولوژی می باشد. از آنجایی که فرم فعال هورمون رشد به صورت غیرگلیکوزیله است، سیستم های بیان پروکاریوتی برای بیان این نوع پروتئین ها ترجیح دارد. سیستم بیان ژن کنترل شده با نیسین یکی از موفق ترین و گسترده ترین ابزار استفاده شده برای تنظیم بیان ژن در باکتری های گرم مثبت می باشد. این سیستم بیان اطمینان می دهد که ژن مقاومت به آنتی بیوتیک و آنتی بیوتیک در پروتئین به دست آمده حضور ندارند. هدف از این مطالعه تولید هورمون رشد انسانی به عنوان یک پروتئین دارویی در l. lactis می باشد. ژن هورمون رشد انسانی نوترکیب با روش pcr تکثیر و با آنزیم های ncoi و saciهضم شد و در وکتور pnz8149 کلون شد. سپس وکتور نوترکیب با روش الکتروپوریشن به داخل l. lactis nz3900 منتقل شد و کلنی های حاوی پلاسمید انتخاب شدند. غربالگری براساس توانایی رشد بر روی لاکتوز می باشد. حذف ژن lacf باعث عدم رشد این سویه بر روی لاکتوز می شود مگر اینکه این ژن از طریق پلاسمید فراهم شود. باکتری های ترانسفورم شده با pcr،آزمایش هضم و تعیین توالی dna شناسایی شدند. سلول های l. lactis nz3900 در محیط m17با 5/0% لاکتوز رشد داده شدند. القاء با ng/ml5 نیسین در تراکم سلولی یاod600 برابر با 4/0 انجام شد. بعد از 5 ساعت سلول ها از محیط جدا شدند و عصاره بدون سلول آماده شد. تولید پروتئین هورمون رشد انسانی نوترکیب با استفاده از روش های الایزا، دات بلات، sds-page و وسترن بلات تأیید شد. ژن هورمون رشد انسانی با موفقیت در وکتور pnz8149 کلون و به باکتری l. lactis nz3900 منتقل شد. پروتئین هورمون رشد به میزان ?g/ml 59/1 تولید شد.